تعیین توالی DNA
تعیین توالی DNA یک روش آزمایشگاهی و از مهم ترین دستاوردهای روز به حساب می آید به طوری که امروزه روش های متفاوتی برای تعیین توالی نوکلئوتیدها در یک مولکولDNA به کار گرفته می شود.
چندشکلی‌های موجود در سطح DNA را مي‌توان با استفاده از روش‌هاي متنوعی مطالعه کرد. بدون شک مستقیم‌ترین استراتژي، تعيين توالي نوکلئوتيدي ناحيه مشخص است و تعیین اين توالي در يک ناحيه ارتولوگ در ژنوم موجودات تا حدودی مرتبط می باشد. با افزایش منطقه مورد بررسی، وسعت همولوژی بین دو ژنوم کاهش می‌یابد لذا لازم است برای تعیین روابط فیلوژنیک از روش‌ها و شیوه‌های محاسباتی جدید استفاده کرد.
توالی‌یابی DNA مجموعه اطلاعات بسیار محکم، قابل تکثیر و ارزشمند را در اختيار محقق قرار مي‌دهد و اين امکان وجود دارد که در مناطق ژنومي خاص مورد نظر محقق انجام شود. اما وقتی تعداد نمونه‌هاي آزمایش زیاد باشد توالی‌یابی DNA بسیار ملال‌آور و پرهزینه است (از جمله در مطالعه ژنتیک جمعیت، فیلوژئوگرافی و برنامه‌های اصلاح نژاد گیاهی به کمک نشانگر).
از نقایص دیگر اين روش حداقل برای برخی از تحقیقات، می‌توان به نمونه‌برداری بسیار اختصاصی تنها در قسمت کوچکی از ژنوم اشاره کرد. برای مثال نوسازی فیلوژنی براساس اطلاعات توالی DNA به‌طور معمول منجر به درخت ژنی می‌شود که لزوماً بیانگر درخت گونه‌ای نیست. بسیاری از نشانگرهای مولکولی مبتنی بر PCR در کنار تعیین اندازه تغییرات ژنتیکی در سطح وسیع مورد بحث قرار گرفته‌اند .
توالی‌یابی DNA با ظهور PCR که امکان جدا کردن مناطق ارتولوگ DNA از اندام‌های هدف با سرعت زياد را فراهم می‌کند بسیار تسهیل شد. جفت آغازگرهای عمومی یا پرایمر براساس توالی بخش‌های حافظت شده DNA طراحی شده و نواحی هدف تکثیر شده با PCR به‌طور مستقیم یا بعد از همسان‌سازی توالی‌یابی می‌شود.
اعتبار توالی‌یابی DNA با توسعه‌ی آغازگرهای نشانه‌گذاری شده با فلورسانس و نوکلئوتیدهایی که می‌تواند برای ردیابی خودکار مولکول‌های DNA در ژل یا ابزار توالی‌یابی مورد استفاده قرار‌گیرد افزایش پیدا می‌کند.
توالي‌يابي فلورسانس با قدرت خوانش تا 1200 جفت باز در هر واکنش، قدرت تفکيک‌پذيري بسیار بيشتري از روش‌هاي معمول دارد که با استفاده از رادیوایزوتوپ انجام می‌شود. علاوه بر اين، انجام آن آسان‌‌تر است و اطلاعات حاصل به‌طور مستقیم به کامپيوتر منتقل می‌شود. اين حقیقت که تهیه تجهيزات جدید از امکانات توالي‌يابي سنتي خیلی گران‌تر است، يک مشکل جدي نيست؛ زيرا خدمات توالي‌يابي قديمي هنوز رواج زيادي دارد و تا حدودی کم هزینه است.
سرعت پیشرفت تکنولوژي توالي‌يابي DNA با استفاده از آغازگرهای فلورسانس مسير انجام توالي‌يابي های خيلي بزرگ را هموار کرده و تکميل پروژه‌های توالي‌یابی کامل ژنوم چندين موجود مدل يوکاريوتي شامل مخمر، نماتود Caenorhdodtis elegans، دو اکوتيپ آرابيدوپسيس تاليانا، دو واريته برنج، موش، موش صحرايي، مگس سرکه و انسان را امکان‌پذير ساخت.
انواع روش های توالی یابی
روش‌هاي توالي‌يابي DNA را الفی و اسابل و همکاران بررسي کرده‌اند و امروزه به دلیل پیشرفت های زیاد در زمینه زیست شناسی مولکولی روش های سنتی توالی یابی که عمدتاً روش سانگر است دیگر پاسخگوی محققان نیست؛ بنابراین زیاد شدن تقاضا برای کاهش هزینه توالی یابی به توسعه نسل جدید توالی یابی منجر شد؛ این نسل جدید می تواند به طور همزمان هزاران و یا میلیون ها توالی به صورت همزمان انجام دهد.
روش سانگر
در چندین سال اخیر از روش دی دئوکسی (سانگر) برای توالی یابی استفاده می شد. در این روش قطعاتی از DNA تولید می شود که فقط در یک نوکلئوتید تفاوت دارند و نیازمند کلون کردن هر نقطه شروع برای تولیدDNA تک رشته ای است و این تک رشته به عنوان آغازگر عمل می کند.
در ابتدا برای جداسازی قطعات DNA از ژل پلی اکریل امید استفاده می شد ولی به تدریج ستون های کوچک جایگزین ژل های بزرگ شد. با استفاده از این ستون ها می توان 800-700 جفت باز از قطعات DNA را در طی 2 الی 3 ساعت جداکرد. از مزایای این روش این است که میزان استفاده از مواد شیمیایی و مواد رادیو اکتیودر مقایسه با روش های دیگر کمتر است.
پیشرفت دیگر در توالی یابیDNA، نوکلئوتیدهای فلوئورسنت خاتمه دهنده ی زنجیر است . در این روش آخرین نوکلئوتیدهای هرقطعه یعنی انتهای َ5 با یک رنگ فلوئورسنت نشان دار می شود در نتیجه هر قطعه ویژگی منحصربه فردی دارد و در هر ساعت می توان 800-600 جفت باز را جداسازی و رمزگشایی کرد.
دستگاه های تعیین توالی نسل جدید در اصطلاح Read گفته می شود .
تعیین توالی با توان عملیاتی بالا
در مدت زمان کوتاه طول بزرگی از نمونه ها تعیین توالی می شوند.
تکنیک های جدید توالی یابیNGS نیازی به همسان سازی ندارد اما نیازمند کامپیوترهای پیشرفته ونرم افزار و دانش تخصصی است و می تواند میلیون ها توالی (بسته به نوع سیستم استفاده شده) را در طی چند روز بخواند و این روش جایگزین روش سانگر شده است؛ اما به دلیل هزینه و زمان بر بودن زیاد مورد استفاده قرار نمی گیرد.
روش payrosequencing
این تکنولوژی برای توالی یابی ژنوم شناخته شده است و به منظور تشخیص جهش های بیماری زا به خوبی عمل می کند. در این روش از طریق دناتوراسیون محصولات PCR، یک رشته DNA به عنوان الگو به دست می آید. روش Payro می تواند 700 جفت باز توالی یابی کند؛ یکی از مهم ترین ویژگی های این روش سرعت بالای آن است ولی در نواحی هموپلیمر DNA درصد خطا و هزینه بالا رخ می دهد.
روش ماکسام گیلبرت
این روش به تغییر شیمیایی DNA و ایجاد شکاف در بازهای خاص معروف می باشد.
در روش ماکسام گیلبرت انتهای َ5 توسط مواد رادیواکتیو نشاندار می شود و توسط مواد شیمیایی شکست در نسبت کوچکی از 1 یا 2 نوکلئوتید از مجموع 4نوکلئوتید انجام می شود و در نهایت قطعه خالص سازی شده تعیین توالی می شود. این روش منجر به ابداع سنجش تداخلی متیلاسیون شد که در پیدا کردن مکان های اتصال پروتئین به DNA استفاده می شود.
روش Torrent ION
این روش برای تشخیص نوکلئوتیدها مورد استفاده قرار می گیرد و در آن از یک سیستم نیمه رسانا استفاده می شود که با تکنیک تغییر PH به واسطه رها شدنH در هنگام سنتز رشته جدید در محیط صورت می پذیرد. تفاوت این روش با پایروسکوئنسیگ در این است که دارای یک حسگر یونی قوی که تغییرات PH را ثبت می کند و در نهایت آن را به صورت یک پیک نشان می دهد و بسته به تعداد نوکلئوتید ها شدت ارسال پیام کم یا زیاد می شود.
روش solexa
در این روش ژنوم به 150-100 جفت باز از قطعات DNA شکسته می شود و قبل از اینکه فرایند تک رشته شدن اتفاق بیفتد به دو سمت این قطعات آداپتور متصل می شود؛ در نتیجه قطعات تک رشته در یک سطح جامد توزیع می شود.
سیگما ایران، شرکت فروش مواد شیمیایی آزمایشگاهی از برترین برند های دنیا
مرکز فروش مواد شیمیایی آزمایشگاهی، فروش مواد آزمایشگاهی، فروش کیت تحقیقاتی و تجهیزات آزمایشگاهی از معتبر ترین برندهای دنیا از جمله سیگما آلدریچ، مرک آلمان، ترموفیشر، پرومگا، فلوکا و …
