استخراج RNA | استخراج RNA چیست

استخراج RNA | استخراج RNA چیست

استخراج RNA | استخراج RNA چیست :

حساسیت کار با RNA نسبت به DNA بسیار بالاتر می باشد.زیرا RNA ازلحاظ  شیمیایی  پایداری کمتری برخوردار می باشد و در همه مکانها RNAse موجود می باشد. برخلاف dnase، rnase ها در دمای بالا یا اتوکلاو (Autoclave) میتوانند فعالیت خود را حفظ کنند.بنابراین در زمان کار با RNA نیازمند اقدامات احتیاطی بیشتری می باشد. هنگام کار با RNA حتما دستکش پلاستیکی یکبار مصرف  استریل بپوشید.حتی بعد از پوشیدن دستکش سطوح و تجهیزات را لمس نکنید. یک مکان ویژه برای کار با RNA اختصاص بدهید.

میز کار و سطوح شیشه ای رو کاملا با اتانول 100 درصد ضدعفونی کنید. مخازن الکتروفورزی که برای آنالیز RNA استفاده می شود باید با SDS( سدیم دو دوسیل سولفات) 1 درصد شسشتو داده شود.سپس با H₂O₂ سه درصد به مدت 10 دقیقه شستشو داده شود. ظروف شیشه ای باید به مدت 4 ساعت در دمای 180 تا 200 درجه سانتی گراد پخته شوند. اتوکلاو تنها کفایت نمی کند.

بهتر است از ظرف پلاستیکی یکبار مصرف ارزان قیمت استفاده شود. اگرقرار است  وسایل پلاستیکی مجددا استفاده شود بهتر است به مدت 2 ساعت در دمای 37 درجه سانتی گراد در محلول 1/0 مولار NAOH و یک میلی مولار EDTA(اتیلن دی آمین تترا استیک اسید) شستشو داده شود و با آب دپس (DEPC)  diethylpyrocarbonateتیمار شوند.و سپس به مدت 15 دقیقه در دمای 100 درجه سانتی گراد گرمادهی شود.

تمام محلولها باید با آب DEPC تهیه شود. برای کسب نتیجه بهتر باید نمونه ها بصورت تازه تهیه شوند و به سرعت در نیتروژن مایع (70-) نگهداری شوند.زیرا با کاهش فعالیت RNase آسیب به rna به حداقل می رسد.تمام واکنش ها باید بر روی یخ صورت گیرد. مهارکننده های RNase ها میتوانند از rna در طی مراحل جداسازی و خالص سازی محافظت کنند.این مهارکننده ها پروتئین های یوکاریوتی هستند که با ایجاد پیوندهای کوالانسی وغیرقابل برگشت با RNase از rna محافظت می کنند.

نگهداری RNA باید در اتانول یا ایزوپروپانول و در دمای 70- صورت گیرد.زیرا در این دما بیشترین پایداری را دارد. با حذف اتانول و ایزوپروپانول به کمک سانتریفیوز و در بافر فاقد RNase نگهداری شود. در صورت امکان هم cDNAنگهداری شود. RNA را به مدت 15 دقیقه در دمای اتاق و مکان تمیز خشک کنید.

RNA در دمای بالا پایدار نمی باشد بنابراین از دمای بالاتر از 65 درجه سانتی گراد اجتناب شود زیرا باعث برهم خوردن یکپارچگی RNA می شود. برای خرد کردن ساختارهای ثانویه در RNA به مدت 15 دقیقه در دمای 65 درجه سانتی گراد  در حضور بافرهای دناتوره کننده استفاده شود.

میانگین وزن مولکولی ( MW) برای ریبونوکلوتیدها: 340 دالتون. وزن مولکولی برای ssRNA برابر است با تعداد بازها ضربدر 340 دالتون. برای مثال وزن مولکولی tRNAدر باکتری Ecoli که دارای 75 باز دارد 5/25  کیلو دالتون می باشد. RNAخالص دارای نسبت A260/ A280 کمتر یا مساوی 2 دارند.

در بیشتر موارد از ژل آگارز 1 درصد برای جداسازی مولکول های  ssRNA استفاده می شود.